基因槍的原理、操作方法和注意事項

基因槍的原理

基因槍法，又叫粒子轟擊細(xì)胞法或微彈技術(shù)?；驑尩淖饔檬怯脡嚎s氣體(氦或氮等) 動力產(chǎn)生一種冷的氣體沖擊波進(jìn)入轟擊室(因此可免遭由“熱”氣體沖擊波引起的細(xì)胞損傷)，把粘有DNA 的細(xì)微金粉打向細(xì)胞，穿過細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等層層構(gòu)造到達(dá)細(xì)胞核，完成基因轉(zhuǎn)移。只有很少部分的細(xì)胞符合這樣的要求，大多數(shù)會因為力道不對而失敗，但這少部分細(xì)胞已足夠完成基因轉(zhuǎn)移操作的需要。利用氦氣、金粉的原因主要是: 密度大，穿孔容易; 口活性小，不易毒害細(xì)胞。

基因槍根據(jù)動力系統(tǒng)可分為火藥引爆、高壓放電和壓縮氣體驅(qū)動三類。其基本原理是通過動力系統(tǒng)將帶有基因的金屬顆粒（金粒或鎢粒），將DNA吸附在表面，以一定的速度射進(jìn)植物細(xì)胞，由于小顆粒穿透力強，故不需除去細(xì)胞壁和細(xì)胞膜而進(jìn)入基因組，從而實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的目的。它具有應(yīng)用面廣，方法簡單，轉(zhuǎn)化時間短，轉(zhuǎn)化頻率高，實驗費用較低等優(yōu)點。對于農(nóng)桿菌不能感染的植物，采用該方法可打破載體法的局限。基因槍的轉(zhuǎn)化頻率與受體種類、微彈大小、轟擊壓力、制止盤與金顆粒的距離、受體預(yù)處理、受體轟擊后培養(yǎng)有直接關(guān)系。

基因槍的操作方法

l．材料準(zhǔn)備 在9cm2培養(yǎng)皿上鋪一薄層培養(yǎng)基,把材料(一般用未成熟胚、成熟胚、小愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等)平鋪于培養(yǎng)皿中心,直徑在3cm范圍內(nèi).
2．金粉的處理 取60mg金粉或鎢粉置于離心管中,加入lml無水乙醇,充分振蕩3min,以9615g離心1rain,去上清,再加入lml無菌水充分混勻后,以9615g離心,重復(fù)上述步驟3次.zui后,將金粉懸浮于lml無菌蒸餾水中,置4‘c或室溫下儲存.
3．dna的處理 取50ta金粉懸浮液,依次加入5rd的質(zhì)粒dna(1．0／lg～1)溶液、50／／l 0．1mol／l亞精胺(所用的溶液經(jīng)無菌),振蕩3rain后,在室溫下放置10min,以9615g離心10s,棄去上清液；加入250~1無水乙醇,振蕩后以9615g離心10s,棄上清液.沉淀重新懸浮于60／1l無水乙醇中,可供5槍(每槍10~1)使用.
4．基因槍的操作 基因槍的操作均在無菌條件下進(jìn)行,具體步驟如下: 
1)先用70％乙醇對基因槍表面及樣品室進(jìn)行.同時,用70％乙醇將阻擋網(wǎng)和可裂圓片,微彈載體及其固定器、固定工具浸泡15min后,放在超凈臺上晾干.可裂膜片、固定蓋、微彈載體發(fā)射裝置可用70％乙醇進(jìn)行表面滅菌,吹干. 
2)將微粒載片嵌入固定環(huán)中,取dna及金粉的混合物加于微粒載片中心,干燥lmin左右. 
3)安裝可裂膜于其托座上,順時針擰到氣體加速器上. 
4)將空間環(huán)、阻擋網(wǎng)、阻擋網(wǎng)托座、微粒載片及固定環(huán)(帶有微粒的面朝下)安裝好,旋緊蓋子,插入搶中. 
5)把樣品放在轟擊室中,關(guān)好門. 
6)打開氦氣瓶的總閥,順時針轉(zhuǎn)氦氣調(diào)節(jié)閥,使氦壓表指針的示數(shù)高于可裂膜壓力200psi(＝1．379mpa). 
7)打開基因槍及變壓器開關(guān). 
8)按動真空鍵,待真空度至26—28in hg(＝88．05～94．82kpa)時,迅速按下hold鍵,接著按住發(fā)射鍵,并保持不動,直到激發(fā)為止. 
9)按通氣鍵待真空表歸零后,取出樣品. 
10)關(guān)機.把氦氣瓶的總開關(guān)旋緊,打一次空槍,把氦壓表指針歸零后,再逆時針旋轉(zhuǎn)氦壓表調(diào)節(jié)閥；關(guān)閉基因槍的總開關(guān)及變壓器開關(guān).

基因槍的注意事項

1) 質(zhì)粒dna的儲存濃度在槍擊前zui好調(diào)至1ug/ul,這樣有利于制備微粒子彈時的dna取樣.質(zhì)粒dna與金粉形成復(fù)合體的比例以0．75～1pg／mg(金粉)為宜.
2) .質(zhì)粒dna的純度和濃度是影響轉(zhuǎn)化率的重要參數(shù)之一.一般每槍用0．75～l／1gdna.
3). 亞精胺zui好是現(xiàn)用現(xiàn)配,或者儲存于一20~c冰箱中(時間不超過1個月).如沒有保存好或保存時間過長,亞精胺會發(fā)生降解,從而影響dna吸附于金屬微粒表面的能力
4) 對于植物材料轉(zhuǎn)化,微粒子彈載體的選擇視受體材料而定.此外,可裂圓片的規(guī)格應(yīng)與微粒子彈載體對應(yīng).

伯樂BIO-RAD Helios 基因槍

Helios 基因槍是一種方便的手提式設(shè)備，可對細(xì)胞進(jìn)行快速直接的原位基因轉(zhuǎn)移。該系統(tǒng)通過可調(diào)節(jié)的氦氣脈沖，
來帶動位于小塑料管內(nèi)壁，包被有 DNA、RNA 或其它生物材料的金粉顆粒，將其直接打入細(xì)胞內(nèi)部。使用樣品管制備站可很容易地制備管內(nèi)子彈。

主要功能

簡單、快速、功能靈活的基因傳送，各種細(xì)胞通用
適用于瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)
只需少量的 DNA 和細(xì)胞，無需載體 DNA
能進(jìn)行多質(zhì)粒共同導(dǎo)入
可輸送大片段 DNA
胞內(nèi)目標(biāo)基因可導(dǎo)入多個細(xì)胞
用于體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)化
沒有無關(guān)的基因或蛋白被轉(zhuǎn)導(dǎo)

伯樂BIO-RAD Helios 基因槍訂購信息：
1652411   Helios Gene Gun Kit, 100/120 V, includes Helios gene gun, 5 O-rings, 5 barrel liners, 5 white cartridge holders, cartridge extractor tool, 9 V battery.
1652431  Helios Gene Gun System,100/120 V, handheld biolistic system, includes helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424).
1652451  Helios Gene Gun Low-Pressure System,100/120 V, handheld biolistic system, includes helium hose assembly with low-pressure regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, tubing cutter, optimization kit (#165-2424).